消毒与灭菌常用方法及设备

消毒与灭菌常用方法及设备 

（一）干热灭菌

【原理】

高温对细菌有明显的致死作用，主要机理是凝固菌体蛋白质，也可能与细菌DNA单螺旋断裂、细菌膜功能受损及菌体内电解质浓缩有关。干烤箱为常用的干热灭菌器，其杀菌作用是通过脱水干燥和大分子变性完成的。

【构造】

干烤箱是中间夹着石棉的双层金属制成的方形或长方形箱，箱底装有热源，箱内有数层金属架，并附有温度计和自动温度调节器等装置。把待灭菌的物件均匀地放入恒温干燥箱，加热至160℃～170℃维持2小时即可达灭菌目的。

【使用方法及注意事项】

1.将包扎好的待灭物品（培养皿、吸管器等）放于箱内，注意不要摆得太挤，以免妨碍气流流通。

2.关门，插上电源插头（常为220伏），拨动开关，旋动恒温调节器，至红灯亮。 

3.待温度上升160℃～170℃时，借恒温调节器的自动控制，保持此温度2小时。 

4.灭菌后停止加热，待温度下降至40℃以下方可开门取物，在这之前切勿自行打开箱门，否则其内物品(如玻璃器皿等)会因温度骤然下降而爆裂。

【应用】

干热灭菌主要用于要求干燥的、耐高温的物品灭菌，如玻璃器材、瓷器、凡士林、液体石蜡、药粉等的灭菌。一般不耐高温的、含有水份的物质，不能用这种方法灭菌。

（二）湿热灭菌

【原理】

高温对细菌有明显的致死作用，主要机理是凝固菌体蛋白质，也可能与细菌DNA单螺旋断裂、细菌膜功能受损及菌体内电解质浓缩有关。湿热灭菌所需温度较低，时间较短(表3-2)。特别是高压蒸气灭菌，因增加压力而提高温度，灭菌效果最佳。其主要优点是：①温度较高，灭菌所需时间较短；②蒸气穿透力强；③蒸气冷凝时释放汽化热，能迅速提高物品的温度；④物品不过分潮湿。

表3-2 热力消毒灭菌法比较

方法

温度(℃)

时间(min)

灭菌器

适用物品

焚烧

＞500

瞬时

废弃物品、动物尸体灭菌

干烤

160～170

120

干热灭菌器（干烤箱）

玻璃器材、瓷器等灭菌

巴氏消毒法

61.1～62.8

71.7

30

15-30s

牛奶、酒类等消毒

煮沸消毒法

100

5

食具、刀剪、注射器等消毒

流通蒸气消毒法

100

15～30

Arnold流通蒸气灭菌器

食具等消毒

间歇灭菌法

100

30

流通蒸气灭菌器(重复3次)

不耐高温的含糖、牛奶等培养基

高压蒸气灭菌法

121

15～30

高压蒸气灭菌器

耐高温、高压及不怕潮湿的物品

高压蒸气灭菌器是目前应用最广泛、灭菌效果最好的灭菌器具，其种类有手提式、直立式、横卧式等。它们的构造及灭菌原理基本相同。高压蒸气灭菌方法的原理是水在大气中100℃左右沸腾，水蒸气压力增加，沸腾时温度将随之增加，因此，在密闭的高压蒸气灭菌器内，当压力表指示蒸气压力增加到15磅(1.05kg/cm)时，温度则相当于121.3℃，在这种温度下20min即可完全杀死细菌的繁殖体及芽胞。

【构造】

高压蒸汽灭菌器有各种形式及规格。下面以常用的高压蒸汽灭菌锅为例进行介绍。高压蒸汽灭菌锅是一个密闭的耐高温和耐高压的双层金属圆筒，两层之间盛水。

①外锅：供装水产生蒸汽之用。坚厚，其上方或前方有金属厚盖，盖有螺栓，借以紧闭盖门，使蒸汽不能外溢。加热后，灭菌器内蒸汽压力升高，温度也随之升高，压力越大，温度越高。

外锅壁上还装有排气阀、温度计、压力表及安全阀。排气阀用于排出空气；压力表：以表示锅内压力及温度（公制压力单位为公斤/cm2、英制压力单位磅/英寸2、温度单位℃）；安全阀又称保险阀，利用可调弹簧控制活塞，超过定额压力即自行放汽减压，以保证在灭菌工作中的安全。

②内锅：为放置灭菌物的空间。

图3-1 高压蒸汽灭菌锅模式图

【使用方法及注意事项】

1.使用前的准备：灭菌器内清洗干净，检查进气阀及排气阀是否灵活有效，并加入适量水。

2.装放灭菌物：将待灭菌的物品放入灭菌器内，注意不要放得太挤，以免影响蒸汽的流通和灭菌效果。然后加盖旋紧螺旋，密封。

3.预热及排气：加热升温使水沸腾，并由小至大打开排气管（排气阀），排除冷空气，继续加热升温，再关闭排气管（阀）。

4.升压保温：让温度随蒸汽压力增高而上升待压力逐渐上升，待蒸汽压力升至所需压力(一般为103.43kPa，温度则相当于121.3℃)时，控制热源，维持所需时间，持续15～20min即可达到灭菌目的。

5.降压开盖取物：保压到规定时间之后，就停止加热，缓缓排气，待其压力下降至零时，方可开盖取物。

6.注意事项

⑴此法灭菌是否彻底的一个关键是压力上升之前，必须先把蒸汽锅内的冷空气完全驱尽，否则，即使压力表已指到103.43kPa，而锅内温度则只有100℃，这样芽孢则不能被杀死，造成灭菌不彻底，所以必须进行排气。 

⑵降压一般通过自行冷却。如果时间来不及，可以稍开排气阀降压，但排气阀不能开得太大，排气不能过急，否则灭菌器内骤然降压，灭菌物内的液体会突然沸腾，将棉塞冲湿，甚至外流。另外，降压时压力表上读数虽已降至“0”时，灭菌物内温度有时还会在100℃以上，如果开锅太快还有沸腾的可能，所以最好在降压后再稍停一会，灭菌物温度下降后再出锅较妥当。灭菌物灭菌后仍处于高温时，容器内呈真空状，降温过程中外部空气要重新进入容器。一般叫“回气”，降温过快，回气就急，如棉塞不严密，空气中杂菌就会重新进入灭菌物使其污染，这往往造成高压蒸汽灭菌的失败。因而降压开盖取物不宜过急。

【应用】

高压蒸汽灭菌可用于耐高温、高压及不怕潮湿的物品，如普通培养基、生理盐水、纱布、敷料、手术器械、玻璃器材、隔离衣等的灭菌。

（三）紫外线杀菌

【原理】

紫外线（ultraviolet ray,UV）是一种肉眼看不见的光波，存在于光谱紫外线端的外侧，故称之为紫外线，依据不同的波长范围，被割分为A、B、C三种波段。紫外线中波长为240nm～280nm具有杀菌能力，其中265～266nm的杀菌作用最强。医学上常使用紫外线灯产生紫外线进行消毒灭菌。

现代紫外消毒杀菌技术是国际上90年代末兴起的最新一代消毒技术。它是基于现代防疫学、光学、数学、生物学及物理化学的基础上，利用特殊设计的高效率、高强度和长寿命的C波段紫外光（240 nm～260nm）发生装置产生的强紫外C光照射流水、空气或固体表面，当水、空气或固体表面中的各种细菌、病毒、寄生虫、水藻以及其他病原体受到一定剂量的紫外C光辐射后，细菌（细胞）DNA相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，从而破坏DNA构型，干扰其正常复制，导致细菌（细胞）变异或死亡。同时，紫外线不仅可杀灭DNA病毒，对RNA病毒（包括SARS-coV等）也有灭活作用。即在不使用任何化学药物的情况下杀灭细菌、病毒以及其它致病体。紫外消毒杀菌技术具有高效率、广谱性、低成本、长寿命和无二次污染的特点，是国际上公认的21世纪的主流消毒技术。

【使用方法及注意事项】

1.医学常用的是水银灯，灯管由石英玻璃制成，管内充满压强为266Pa的氩和几滴水银。紫外线杀菌力虽较强，但穿透力较弱，普通玻璃、纸张、尘埃、水蒸气等均能阻挡紫外线。因此灯管上之灰尘、油渍都会直接影响其穿透能力。所以新灯管在使用前，应用沾以75%酒精的纱布擦拭，清除油渍、手汗及灰尘。使用中的灯管、石英管应定期擦拭清洁，以免影响紫外线穿透率及照射强度。

2.紫外照射灯的安装形式及高度，应根据实际情况，参考使用说明决定。期间，必须考虑到紫外线以下传播性质：紫外线进行直线传播；紫外光强度与距离的平方成比例减弱；可被不同的表面反射，穿透力弱。

3.需预防紫外线辐射。紫外线对细菌有强大的杀伤力，对人体同样有一定的伤害，启动消毒灯时，应避免对人体直接照射，必要时可使用防护眼镜，不可直接用眼睛正视光源，以免灼伤眼膜。

【紫外线杀菌试验】

1. 用无菌接种环取大肠埃希菌肉汤培养物，密集划线接种于普通琼脂平板。

2. 用无菌镊子把经灭菌的黑色纸片贴于平板表面中央部分。

3. 打开皿盖的2/3，置于紫外灯下距离约20cm～30cm处照射30分钟。

4. 除去纸片，盖好平皿盖，置37℃温箱培养18小时～24小时观察细菌生长情况。

结果：纸片及平皿盖遮盖处有细菌生长，未遮盖处无细菌生长。

【应用】

1.空气和物体表面杀菌：传统紫外线灯常用于无菌操作室、外科换药室、病房、手术室及实验室的空气和物体表面的消毒灭菌。一般照射20min～30min即可杀死空气中的细菌。

2.在水处理中的应用：近年来，紫外线杀菌灯在水处理领域有广泛的用途。 水处理（water treatment）从使用紫外线杀菌灯的方法来分，有直接把灯放入水中，称为浸没式；紫外线灯放入套管里使用，称为过流式。（目前主要采用的是过流式的方法。）与过流式相比，浸没式结构简单。紫外线杀菌灯直接放在水中，这种方法可用于流动的动态水，也可用于静态水。这种处理方法要注意灯管有可能由于意外情况发生破裂；长时间处理，灯管表面会被水中藻类等污染物覆盖，将严重影响紫外线透出。

紫外线杀菌灯在水处理中主要应用它的杀菌功能，如过流式的设备工作原理如：经水泵产生压力的一定流速的水流流过能透紫外的石英套管外围，紫外线灯产生的254nm紫外线对水进行消毒、杀菌。其特点是水流流速很快，一般在石英外套流过的时间不超过1秒，因此要求杀菌灯的紫外线强度很高，一般要求在表面强度超过30000uw/cm2。要产生如此高的紫外线强度，需选用高强度大功率的紫外线杀菌灯。如果仍然想通过延长时间来提高消毒效果，一般选用较长的灯，做较长的设备，或在外壁上处理成涡流旋转式结构，来延长水流过的时间。

紫外线杀菌器在水处理方面广泛用于：医院、各类实验室用水消毒，以及高含量致病体废水消毒；生物化学制药，化妆品生产用冷却水消毒；食品加工工业水体消毒，包括果汁、牛奶、饮料、啤酒、食用油及各类罐头、冷饮制品等用水；生活用水消毒，包括居民住宅小区、办公大楼、自来水厂、旅馆餐厅等；电子工业用超纯水，等等。

（四）过滤除菌

在实验室最常用的过滤除菌法主要包括：其一是利用滤菌器除去不耐高温液体中的细菌；其二是利用生物安全柜除去气体中可能含有的病原微生物。

1.滤菌器

【原理】

滤菌器种类很多，孔径非常小，能阻挡细菌通过。它们可用陶瓷、硅藻土、石棉或玻璃屑等制成。适用于除去对热不稳定的药品溶液或液体物质中的细菌的方法。

过滤除菌的效果与滤膜的性能、孔径的大小、密度、滤膜的厚度等因素有关。滤过除菌法要求最终过滤的滤膜孔径为0.22μm。由于各厂家生产的相同规格的滤膜质量并不一致，为了保证除菌效果，在使用前后应检查滤器的完好性（如压力维持试验或起泡点试验）。一个过滤器的使用时间应根据品种验证后确定，一般不应超过8小时。下面介绍几种常用的滤菌器。

【构造】

【使用方法及注意事项】

将清洁的滤菌器(赛氏滤菌器和薄膜滤菌器须先将石棉板或滤菌薄膜放好，拧牢螺旋)和滤瓶分别用纸或布包装好，用高压蒸汽灭菌器灭菌。再以无菌操作把滤菌器与滤瓶装好，并使滤瓶的侧管与缓冲瓶相连，再使缓冲瓶与抽气机相连。将待滤液体倒入滤菌器内，开动抽气机使滤瓶中压力减低，滤液则徐徐流入滤瓶中。滤毕，迅速按无菌操作将滤瓶中的滤液放到无菌容器内保存。滤器经高压灭菌后，洗净备用。滤板、滤膜，每次用后均需更换。

【应用】

滤菌器滤过除菌主要用于对热不稳定的药品溶液或液体物质（例如血清、毒素、抗毒素、药物等的除菌。但此法不能除去病毒、支原体和L型细菌等。

2.生物安全柜

【原理】

生物安全柜（Biological safety cabinets，BSCs）是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的。简言之生物安全柜就是处理危险性微生物时所用的箱形空气净化安全装置。当操作液体或半流体，例如摇动、倾注、搅拌，或将液体滴加到固体表面上或另一种液体中时，均有可能产生气溶胶。在对琼脂板划线接种、用吸管接种细胞培养瓶、采用多道加样器将感染性试剂的混悬液转移到微量培养板中、对感染性物质进行匀浆及涡旋振荡、对感染性液体进行离心以及进行动物操作时，这些实验室操作都可能产生感染性气溶胶。由于肉眼无法看到直径小于5μm 的气溶胶以及直径为5～100μm 的微小液滴，因此实验室工作人员通常意识不到有这样大小的颗粒在生成，并可能吸入或交叉污染工作台面的其他材料。已经表明，正确使用生物安全柜可以有效减少由于气溶胶暴露所造成的实验室感染以及培养物交叉污染。生物安全柜同时也能保护环境。

需要强调的是：水平和垂直方向流出气流的工作柜（“超净工作台”）不属于生物安全柜，也不能应用于生物安全操作。一般来说，超净工作台提供的是对样品的保护，对操作者和环境是不提供保护的；广义上的生物安全柜同时提供对操作者、环境和样品的保护。

【生物安全柜的构造及选择】

多年以来，生物安全柜的基本设计已经历了多次改进。主要的变化是在排风系统增加了高效空气过滤器 (high efficiency particulate air filter，HEPA filter)。对于直径0.3μm 的颗粒，HEPA 过滤器可以截留99.97%，而对于更大或更小的颗粒则可以截留99.99%。HEPA 过滤器的这种特性使得它能够有效地截留所有已知传染因子，并确保从安全柜中排出的是完全不含微生物的空气。生物安全柜设计中的第二个改进是将经HEPA 过滤的空气输送到工作台面上，从而保护工作台面上的物品不受污染。这一特点通常被称为实验对象保护（product protection ）。这些基本设计上的变化使得三种级别的生物安全柜都得到了改进。

生物安全柜可分为Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级三大类以满足不同的生物研究和防疫要求。

Ⅰ级生物安全柜（class Ⅰbiosafety cabinet）：至少装置一个高效空气过滤器对排气进行净化，工作时柜正面玻璃推拉窗打开一半，上部为观察窗，下部为操作窗口，外部空气由操作窗口吸进，而不可能由操作窗口逸出。工作状态时保证工作人员不受侵害，但不保证实验对象不受污染。目前已较少使用。

Ⅱ级生物安全柜（class Ⅱ biosafety cabinet）：Ⅱ级生物安全柜是目前应用最为广泛的柜型。至少装置一个高效空气过滤器对排气进行净化，工作空间为经高效过滤器净化的无涡流的单向流空气。工作时正面玻璃推拉窗打开一半，上部为观察窗，下部操作窗口。外部空气由操作窗口吸进，而不可能由操作窗口逸出。工作状态下遵守操作规程时既保证工作人员不受侵害，也保证实验对象不受污染。按照目前世界上最通用的生物安全柜国际认证的标准-美国NSF49规定，Ⅱ级生物安全柜依照入口气流风速、排气方式和循环方式可分为4个级别：A1型，A2型,B1型和B2型。

Ⅱ级A1型安全柜前窗气流速度最小量或测量平均值应至少为0.38m/s，70%气体通过HEPA过滤器再循环至工作区，30%的气体通过排气口过滤排除；A2型安全柜前窗气流速度最小量或测量平均值应至少为0.5m/s，70%气体通过HEPA过滤器再循环至工作区，30%的气体通过排气口过滤排除。

Ⅱ级B型生物安全柜均为连接排气系统的安全柜。连接安全柜排气导管的风机连接紧急供应电源，目的在断电下仍可保持安全柜负压，以免危险气体泄漏如实验室。其前窗气流速度最小量或测量平均值应至少为0.5m/s(100fpm)。B1型70%气体通过排气口HEPA过滤器排除，30%的气体通过供气口HEPA过滤器再循环至工作区；B2型为100%全排型安全柜，无内部循环气流，可同时提供生物性和化学性的安全控制。

Ⅲ级生物安全柜（class Ⅲ biosafety cabinet）：至少装置一个高效空气过滤器对排气进行净化，工作空间为经高效过滤器净化的无涡流的单向流空气，正面上部为观察窗，下部为手套箱(Golve box)式操作口。Ⅲ级生物安全柜是为4级实验室生物安全等级而设计的，柜体完全气密，工作人员通过连接在柜体的手套进行操作，试验品通过双门的传递箱进出安全柜以确保不受污染。箱内对外界保持负压可确保人体与柜内物品完全隔绝，适用于高风险的生物试验。

生物安全柜的选择时，在根据生物安全防护实验室的级别基本要求（参照“微生物和生物医学实验室生物安全通用准则”）选择的同时，还需参考下列所需保护的类型来选择适当的生物安全柜：实验对象保护、操作危险程度1～4 类微生物时的个体防护、暴露于放射性核素和挥发性有毒化学品时的个体防护、或上述各种防护的不同组合。例如，针对危险程度1～3 类微生物操作的个体防护中可选择Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级生物安全柜；针对危险程度4 类微生物，在手套箱型实验室宜选择Ⅲ级生物安全柜，在防护服型实验室也可选择Ⅰ级、Ⅱ级生物安全柜；实验对象保护，宜选择Ⅱ级生物安全柜，柜内气流是层流的Ⅲ级生物安全柜；少量挥发性放射性核素/化学品的防护，宜选择Ⅱ级B1 型生物安全柜，外排风式Ⅱ级A2型生物安全柜；挥发性放射性核素/化学品的防护，宜选择Ⅰ级、Ⅱ级B2 型、Ⅲ级生物安全柜。

【操作主要注意事项】

1.缓慢移动原则：为了避免影响正常的风路状态，柜内操作时手应该尽量平缓移动。

2.物品平行摆放原则：为了避免物品和物品之间的交叉污染现象产生，在柜内摆放的物品应该尽量呈横向一字摆开，避免回风过程中造成交叉污染。同时避免堵塞背部回风隔栅影响正常风路。

3.避免震动原则：柜内尽量避免震动仪器（例如离心机、旋涡振荡器等）的使用，因为震动会使得积留在滤膜上的颗粒物质抖落，导致操作室内部洁净度降低，同时如果在前操作面平衡失败还会引起安全柜对操作者的污染。

4.不同样品柜内移动原则：柜内两种及以上物品需要移动时，一定遵循低污染性物品向高污染性物品移动原则，避免污染性高的物品在移动过程中产生对柜体内部的大面积污染。

5.明火使用原则：柜内尽量不要使用明火！因为在明火使用过程中产生的细小颗粒杂质将被带入滤膜区域，这些高温杂质会损伤滤膜。无法避免一定需要使用的时候，宜使用低火苗的本生灯。

【应用】

在“微生物和生物医学实验室生物安全通用准则”（中华人民共和国卫生行业标准WS233－2002）中指出生物安全柜就是处理危险性微生物时所用的箱形空气净化安全装置，并对各级生物安全柜的标准进行了明确规定。同时，在实验室生物安全防护的基本原则中提出，生物安全柜是最重要的安全设备，形成最主要的防护屏障。实验室应按要求分别配备Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级生物安全柜。所有可能使致病微生物及其毒素溅出或产生气溶胶的操作，除实际上不可实施外，都必须在生物安全柜内进行。不得用超净工作台代替生物安全柜。