器皿的包扎与灭菌

   一、目的要求

　　1．掌握高压蒸汽和干热灭菌方法和原理。

　　2．掌握器皿的包扎方法。

　　二、基本原理

干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160—170℃），时间长（1—2小时）。但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烤焦，甚至引起燃烧。

高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

　　在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低（表Ⅵ-2），二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100℃时，由气态变为液态时可放出2．26kJ（千焦）的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。

　　在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见表Ⅵ-4。

一般培养基用1．05kg /cm²，121．3℃15—30分钟可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如含糖培养基用0．56kg/cm²（8磅/英寸²），112．6℃灭菌15分钟，但为了保证效果，可将其他成分先行121．3℃，20分钟灭菌，然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。又如盛于试管内的培养基以1．05kg/cm²，121．3℃灭菌20分钟即可，而盛于大瓶内的培养基最好以1．05kg/cm²灭菌30分钟。

　　蒸汽压力所用单位为kg/cm²（千克/厘米²），它与lb/in²（磅/英寸²）和温度的换算关系见表Ⅵ-5。

实验室中常用的高压蒸汽灭菌锅有立式、卧式和手提式等几种。本实验介绍手提式高压蒸汽灭菌锅的使用方法。

　　三、器材

　　培养皿，试管，吸管，电烘箱，牛肉膏蛋白胨培养基，培养皿（6套一包），手提式高压蒸汽菌锅等。

　　四、操作步骤

（一）干热灭菌　　

1．装入待灭菌物品

　　将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电烘箱内，物品不要摆得太挤，以免妨碍热空气流通。同时，灭菌物品也不要与电烘箱内壁的铁板接触，以防包装纸烤焦起火。

　　2．升温

　　关好电烘箱门，插上电源插头，拨动开关，旋动恒温调节器至红灯亮，让温度逐渐上升。如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内已停止加温，此时如果还未达到所需的160—170℃温度，则需转动调节器使红灯再亮，如此反复调节，直至达到所需温度。

　　3．恒温

　　当温度升到160—170℃时，借恒温调节器的自动控制，保持此温度2小时。

　　4．降温

　　切断电源，自然降温。

　　5．开箱取物

待电烘箱内温度降到70℃以下后，打开箱门，取出灭菌物品。注意电烘箱内温度未降到70℃以前，切勿自行打开箱门，以免玻璃器皿炸裂。

（二）高压蒸汽灭菌

1．首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。

　　2．放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。

　　3．加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

　　4．用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用 1．05kg/cm²，121．3℃，20分钟灭菌。

　　5．灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。

　　6．将取出的灭菌培养基放入 37℃温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。