植物组织培养室及培养用具的消毒与灭菌

一、目的要求
1、通过实验，培养学生良好的卫生观念，确立组织培养的无菌意识。
2、掌握组织培养室的消毒及灭菌方法。
3、掌握培养用具的干热灭菌的一般操作技术。
二、仪器与用具
1、用具：喷雾器、工作服、口罩、手套等。
2、药品：2%新洁尔灭，高锰酸钾，甲醛，70%酒精。
三、方法步骤
（一）植物组织培养室的灭菌
1、地面、墙壁和工作台的灭菌：用2%新洁尔灭喷雾。
（1）配方：取新洁尔灭原液20ml，加水980ml，配成2%新洁尔灭溶液。
（2）方法：将配好的2%新洁尔灭溶液倒入喷雾器内，进行均匀喷雾。
（3）注意事项：
①墙壁、角落、地面喷雾要均匀，不要遗漏；
②注意安全，在喷房顶时，要特别小心，防止药液雾滴掉入眼睛。
2、无菌室和培养室的灭菌：用甲醛和高锰酸钾熏蒸，1年中熏蒸1-2次。
（1）配方：每立方米空间用甲醛10ml加高锰酸钾5g的配比液熏蒸。
（2）方法：首先房子要密封。然后在房子中间放一口缸或大烧杯，将称好的高锰酸钾放入缸内，再把已称量的甲醛溶液慢慢倒入缸内，完毕，人迅速离开，并关上门，密封3天。
（3）注意事项：
①操作前要戴好口罩及手套；
②倒入甲醛时要小心，因为甲醛遇到高锰酸钾会迅速沸腾，并产生大量烟雾。操作时人要迅速避开烟雾；
③3天后，打开房间，搬走费液缸；一周后，方可进入操作。
3、在已经熏蒸过的房间内，用70%酒精纱布擦洗培养架、工作台。
4、用紫外灯照射20—30min。
5、使用前，再用70%酒精喷雾，使空间灰尘落下。
（二）培养基的灭菌——高压蒸汽灭菌（湿热灭菌法）
（1）洗涤：把组织培养基用的培养皿、三角瓶、试管等玻璃器皿进行彻底清洗。自然晾干或烘箱干燥。
（2）包扎：用牛皮纸、报纸、纱布或锡箔纸把玻璃器皿和金属器械分别包扎好。
（3）装水：在高压灭菌锅内装入一定量的水（水要淹没电热丝）。（切忌干烧！）
（4）装物品：在灭菌锅内放入含培养基的培养瓶或三角瓶、装蒸馏水的玻璃瓶，以及包扎好的玻璃器皿和金属器械等。
（5）灭菌：将排气阀开着，加热，直至锅内释放出大量水蒸气（此时水蒸气横向喷出），再关闭阀们；或者当锅内压力升至49.0KPa时，开启排气阀，将锅内的冷空气全部排出。当锅内压力达到108KPa时，温度为121℃时，维持15-20分钟，即可达到灭菌的目的。（若灭菌时间过长，会使培养基中的某些成分变性失效。）切断电源，让灭菌锅自然冷却。
注意：①先打开放气阀，再打开锅盖。（以免锅内压力大而爆炸！）
②开盖后应尽快转移培养瓶，使培养瓶冷却、凝固。一般应将灭菌后的培养瓶储藏于30℃以下的室内，最好储藏在4-10℃的条件下。
③某些生长调节剂如IAA、ZT、ABA等以及某些维生素遇热是不稳定的，不能同培养基一起高压灭菌，而需要进行过滤灭菌。
2、培养用具的灭菌——干热灭菌法
（1）玻璃器皿的灭菌：湿热灭菌法或干热灭菌法。
（2）金属器械的灭菌：干热灭菌或火焰灭菌法。
（3）布质制品的灭菌：均用湿热灭菌法。（注意：布质制品绝不能干热灭菌！）
干热灭菌方法：
（1）洗涤：把组织培养用的培养皿、三角瓶、试管、移液管等玻璃器皿进行彻底清洗。（2）包扎：玻璃器皿可放在大的玻璃容器中，金属器械可放在金属盒内。
（3）灭菌：器皿在烘箱中，150℃，干热灭菌1小时；或120℃，2小时。灭菌完毕，待冷却后取出。