细菌的分布及消毒灭菌

一、实验目的
1.证明细菌在自然界和正常人体的分布，以树立严格的无菌观念；
2.掌握各种常用消毒灭菌的方法；
3.了解影响灭菌效果的因素。
二、实验物品
酒精灯  无菌棉签   普通平板    酒精棉球    络合碘棉球等
三、实验内容
㈠ 细菌的分布
1．空气中细菌的检查
由于空气中缺少细菌生长的营养物质及适宜的生长温度，细菌不能繁殖，并且因紫外线和干燥作用，大量细菌在空气中死亡，抵抗力较强的细菌在空气中能长期存活
⑴方法：
   将普通平板开盖放置空气中10分钟，然后于37℃温箱培养24小时。
⑵目的：
①证明空气中有细菌存在，除细菌外，还有真菌，树立严格的无菌观念
②空气中的细菌是培养基、生物制品、医药制剂以及手术室等污染的来源，因此，从事上述工作时，应严格按照有关制度和无菌技术进行
⑶空气中细菌污染指标：
测定1立方米空气中细菌总数和链球菌数作为细菌污染空气的指标
2．咽喉部细菌检查
正常人的体表与外界相通的口腔、鼻咽腔、泌尿生殖道等都存在着不同种类和数量的微生物，咽喉部也一样。
⑴方法：
点燃酒精灯，用无菌棉签在颚垂弓(小舌头)下面粘取分泌物，接种于普通平板上，用棉签划原划线，再用接种环作分离划线，置37℃温箱培养24小时。
⑵目的：
证明在呼吸中，有细菌呼出，因此，在微生物实验中要注意保持安静，树立严格的无菌观念。
⑶注意事项：
注意无菌操作，不要碰到口腔其它部位。
3.水中细菌总数的测定：
⑴目前我国规定应用水的标准：1ml水中的细菌总数不超过100个，1000ml水中大肠菌群数不超过3个
⑵测定方法：
先将水龙头用清洁布拭干，再用酒精灯烧灼消毒水龙头周围，（烧灼龙头是避免龙头周围的细菌污染待检水）然后把水龙头完全打开（避免其它部位细菌的污染），放水5分钟（常用水龙头放水1-3分钟，不常用水龙头放水5分钟），再将水龙头关小，采集水样，放置于灭菌的三角烧瓶内，约100ml，用无菌吸管吸取1ml充分混匀的水样（振摇5-10min），注入直径9mm的无菌平板中，再倾注约15ml已溶化并冷却到50度左右的营养琼脂，立即旋转摇匀平板使水样与培养基充分混和。每一个水样应倾注2个平板，待冷凝固后，翻转平板，使底面向上，37度，24小时进行菌落计数即水样1ml中的细菌总数
㈡ 皮肤手指消毒试验
⒈操作方法：
⑴两人为一组，一个无菌平板，分别标注“消毒前”和“消毒后”；
⑵先将任一手指在“消毒前”的培养基表面轻轻涂抹，然后将其用碘酒、75%酒精，由内向外作皮肤消毒后，待干，在“消毒后”的培养基表面轻轻涂抹（均要在酒精灯旁进行无菌操作）；
⑶在平板底部贴上标签，37℃培养24小时。
⑵注意事项：
①碘对皮肤有刺激，故用75%的酒精脱碘，并且75%的酒精可起到进一步杀菌的作用
②等手上酒精干了后，再在平板上涂抹。
㈢ 紫外线杀菌试验（示教）
⒈原理：
紫外线（Ultraviolet radiation   UV）在波长210-300nm之间有杀菌作用，其中在265-266nm最强，微生物被紫外线照射后，DNA分子形成胸腺嘧啶双聚体，干扰DNA的正常复制，导致细菌发生突变或死亡，此外还可使分子氧变成臭氧，臭氧也具有杀菌作用。
⒉构造：
低压水银蒸气灯
⒊方法：
⑴将细菌接种与无菌平板上；
⑵在平板中央贴一张灭菌纸片，置紫外灯下照射30分钟；
⑶弃去纸片，在37℃培养24小时。
⒋结论：
⑴紫外线有杀菌作用，无纸片盖住部分的细菌被杀死，无细菌生长；
⑵紫外线穿透力弱，被纸片盖住的地方有细菌的生长；
⑶紫外线常用于空气和物体表面的消毒。
⒌用途：
只用于手术室、病房、无菌室的空气消毒及物体表面的消毒
⒍注意事项：
紫外线对人体皮肤、角膜均有损伤作用，应注意保护
㈣高压蒸汽灭菌器
 1．构造：
此种灭菌器为一个双层的金属圆筒，两层之间盛水。外层坚厚，其上有金属厚盖。厚盖附有螺旋，借以扣紧盖门，使蒸气不能外溢。随着蒸气压力升高，筒内的压力也会升高。高压蒸气灭菌器上装有排气阀、安全阀，以调节器内压力，装有的温度计及压力表以示内部温度和压力。器内装有带孔的金属搁板，用以放置欲灭菌对象。
2．使用方法：
  ⑴加水放物品
加水至锅内达规定的水平面，放入需要灭菌物品，并放入检测灭菌效果的试纸条，把盖按对称的螺旋先后对称用力（切勿单个依次）扭紧，使锅盖确实均匀密闭
⑵通电加热，放冷气
通电加热使锅内产生蒸气，当压力表指针达到0.35公斤/cm2时，打开排气阀，将冷空气排出。此时压力表指针下降，当指针下降至零时，将阀门关好。
⑶继续加热，维持压力
继续加热，锅内蒸气增加，压力表指针有上升。当压力达到所需压力后，即调节热源，维持20～30分钟，可完全杀死细菌的繁殖体和芽孢。
⑷停止加热
灭菌时间到达后，停止加热，待压力自行下降到零时方可慢慢开放排气阀，排尽余气，打开锅盖，取出灭菌物品。
⑸检测灭菌效果
指示卡颜色同于或深于标准色，灭菌合格，反之，则需重新灭菌，也可用指示菌株进行测定，国际通用的代表菌株为嗜热脂肪芽孢杆菌（ATCC  7953），将带有此菌的载体布片或滤纸片置于灭菌器内，灭菌后取出菌片，接种于溴甲酚紫蛋白胨水中，56度培养48小时，颜色未变，说明达到灭菌的效果，若外观液体混浊，颜色变黄，说明未将芽孢杀死，未达到灭菌效果，应寻找原因后重新灭菌
3．注意事项：
⑴灭菌物品不应放置过挤，妨碍蒸气流通，影响灭菌效果；
⑵必须将冷空气充分排除，否则压力表上所示压力并非全部是蒸气压力，灭菌将不彻底；
⑶灭菌过程中及灭菌完毕，切不可突然打开排气阀门放气减压，以免瓶内液体外溢。
⑷及时检测灭菌效果
㈤干热灭菌器（干烤箱）
1．构造：
由双层铁板制成的长方形金属箱，外壁内层装有隔热石棉板，箱壁中装置电热线圈，上有安插温度计及供空气流通的孔。箱内有金属板架数层，箱前有铁门及玻璃门，并安装有温度调节器以保持所需温度。
 2．使用方法：
干热灭菌时，需升温达160℃，维持2h。将需灭菌的耐热物品包装后放入箱内，关闭箱门，接通电源，使温度升至160℃，维持2h，关闭电源。待箱内温度自然下降40℃以下时，方可开启箱门取物。
3．注意事项：
⑴箱内温度不可超过180℃，否则棉塞与包扎纸被烧焦。
⑵灭菌后，必须等箱内温度下降至与外界温度相差不多时，方可开门取物，否则冷空气突然进入，易引起玻璃炸裂和热空气外溢灼伤皮肤。
⑶橡胶制品及其他不能耐热高温干热的物品不能用此法灭菌。
⑷放入箱内的物品不宜过挤，而且不能使器皿与内层底板直接接触
4.用途：
烘干物品或干热灭菌，其恒温范围50-200度