植物组织培养灭菌及无菌操作技术
2009-12-08
植物组织培养灭菌及无菌操作技术
［目的要求］
认识各类灭菌剂，掌握其性质、使用方法；通过在超净工作台上进行无菌操作训练，使学生初步掌握组织培养的无菌操作技术，养成无菌操作习惯。
［知识模块］
灭菌技术、无菌操作技术
［重点］
植物组织培养各类设备及人员消毒的方法
［难点］
无菌操作规程
［方法］
采用一体化教学方法，教师借用多媒体进行简要的讲授后学生分组操作实践。
一、植物组织培养灭菌
1．湿热灭菌（培养基）：在制备后的24h内完成灭菌工序。
⑴对高压灭菌后不变质的物品，可以延长灭菌时间或提高压力。
⑵对于一些布制品，洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌20-30min。
⑶高压灭菌前后的培养基，其pH值下降0.2-0.3单位，要控制好灭菌的温度和时间。
⑷高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，从而改变培养基的渗透压。
⑸培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，高压下蔗糖水解大大增强，添加1%活性炭，蔗糖水解率可达5%。
注意事项：防止高压灭菌培养基变化的方法
(1)经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料，及时采取有效措施。
(2)设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量(在0.1%以下)注意pH值对高压灭菌下培养基中成分的影响等。
(3)配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。如将磷、钙和铁放在最后加入。
(4)注意高压灭菌后培养基pH值的变化及回复动态。如高压灭菌后的pH值常由5.80升高至6.48。而96h后又回降至5.8左右。这样在实验中就可以根据这一规律加以掌握。
2.过滤灭菌（不耐热的物质 ）如一些抗生素类物
3.紫外线和熏蒸灭菌（空间）
(1)紫外线灭菌：在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线的波长为200—300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过1.2m为宜。在接种前打开紫外灯进行房间及超净台灭菌30min，然后进行接种。
(2)熏蒸灭菌：用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。
常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按5—8ml／m3用量，将甲醛置于广口容器中，加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。
4.喷雾灭菌（物体表面）
物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用70%的酒精反复涂擦灭菌，l%-2%的来苏儿溶液以及0.25%—1%的新洁尔灭也可以。
5.植物材料表面用消毒剂灭菌（外植体）
从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带人培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。
第一步，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜。
洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。当然，最理想的清洗物质是表面活性物质—吐温。
第二步对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒精浸10～30s。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，加之70%酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。
第三步用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取1—2种使用见表。
常用灭菌剂使用浓度及效果比较表
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灭菌剂
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使用浓度(%)
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持续时间（min）
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去除的难易
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效果
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次氯酸钙
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9～10
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5～30
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易
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很好
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次氯酸钠
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2
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5～30
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易
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很好
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氯化汞
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0.1～1
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5～8
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较难
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最好
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抗菌素
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4～50mg/L
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30～60
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中
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较好
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上述灭菌剂应在使用前临时配制，灭菌后用无菌水涮洗3—4次即可；用升汞液灭菌的材料，难以对升汞残毒较难去除，所以应当用无菌水涮洗8～10次，每次不少于3min，以尽量去除残毒。
灭菌时，把沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中，记好时间，倒人消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底。灭菌时间是从倒人消毒液开始，至倒入无菌水时为止。吐温的用量和灭菌时间，一般加入灭菌液的O.5%，即在100ml加入15滴。
最后一步是用无菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，视采用的消毒液种类，涮洗3-l0次左右。无菌水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。
二、无菌操作技术
一、用品
超净工作台、75％的酒精、95％的酒精、盛有培养基的培养瓶、接种器械（主要指解剖刀、剪刀、镊子等）、酒精灯、培养材料（根、茎、叶或种子等）、0．1％的升汞（或漂白粉）、无菌水等。
二、方法步骤
（一）在接种前4h用甲醛与高锰酸钾混合薰蒸接种室，并打开紫外灯照射30min；
（二）正式接种前半小时左右，打开超净工作台上的紫外灯和风机，20～30min后接种；
（三）用肥皂水洗净双手，在缓冲间内穿好灭过菌的实验服、帽子与拖鞋，进入接种室；
（四）用75％的酒精擦拭工作台面和双手；
（五）用蘸有75％酒精的纱布擦拭装有培养基的培养器皿，放进工作台；
（六）把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95％酒精中，在火焰上灭菌后，放在器械架上；
（七）把植物材料放进75％的酒精中浸泡约30s，再在0．1％的升汞中浸泡5～10min，或在10％的漂白粉上溶液中浸泡10～15min，浸泡时可进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触；然后用无菌水冲洗3～5次；
（八）用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到，打开封口塑料；
（九）取下接种器械，在火焰上灭菌；
（十）把培养材料迅速放入培养瓶，扎上瓶口（每人接种5～10瓶）。操作期间应经常用75％酒精擦拭工作台和双手；接种器械应反复在95％的酒精中浸泡和在火焰上灭菌；
（十一）接种结束后，清理和关闭超净工作台。